RenNano® マウスの主な特徴
1. 完全ヒト重鎖可変領域および修飾された定常領域
2. RenNanoマウスは複数の抗原に対して強力な免疫応答を示します
RenNanoマウスのTFR1、4-1BB、ALBに対する免疫応答。TFR-1および4-1BB（膜抗原）で免疫されたRenNanoマウスの血清を希釈し、抗原発現CHO細胞とともにインキュベートしました。CHO結合HCAbを蛍光標識二次抗体で標識し、フローサイトメトリーを用いて平均蛍光強度（MFI）を測定することで、抗原特異的HCAb力価を測定しました。ALB（分泌抗原）で免疫されたRenNanoマウスの血清を希釈し、蛍光標識二次抗体とともにインキュベートしました。抗原特異的HCAb力価をELISAを用いてOD450で測定しました。
3. RenNano由来の抗原特異的HCAbsは大きな多様性を示します
RenNanoマウス由来のHCAbは多様性に富み、多くはより長いCDR3領域を有しています 抗原特異的HCAbは、重鎖生殖細胞系遺伝子の使用頻度とCDR3の長さに基づいて解析されました。解析の結果、IGHV生殖細胞系における多様性が広く示されました。さらに、観察されたCDR3の長さのほとんどは12アミノ酸を超えており、中には17アミノ酸を超えるものもありました。
RenNano® マウスの検証データ
精製された68種類のRenNano HCAbについて、8つの標的（4-1BB、TROP2、IL3RA、OX40、ネクチン-4、ROR1、PSMA、DLL3）に対する親和性をSPRで試験しました。ほとんどのHCAbsでは、KDは10-6 ~ 10-10 Mの範囲でした。
RenNanoマウスにおけるB細胞発達および分化パターン。RenNanoマウスは野生型マウスまたはRenMabマウスと比較して、外周リンパ器官（脾臓、SP、リンパ節、LN）でB細胞の割合が同等であることがわかりました。RenNanoマウスの脾臓は、野生型マウスやRenMabマウスと比較して、濾胞B細胞（FO-B）および辺縁帯B細胞（MZ-B）の割合が同様であることが示されました。
RenNano HCAbsの物理化学的特性分析。RenNano HCAbsは1回の精製で高純度を示しました（A）。HCAbsはHIC-HPLCおよびCIC-HPLCで短い保持時間を示し、優れた親水性および特異性を示しました（B、C）。RenNano HCAbsはまた、良好な熱安定性を示しました（D）。
次世代RenNano®マウス：
完全ヒト由来とFR2ラクダ化（FERF）ヒトV遺伝子を組み合わせ、VHH発見の可能性を最大化
ヒト重鎖のみの抗体（HCAb）発見のための独自のRenNano®マウスプラットフォームを基盤に、次世代RenNano®マウスは、元の完全なヒトV遺伝子レパトアを保持しつつ、数十の設計されたフレームワーク領域2（FR2）ラクダ化ヒトV遺伝子セグメント
を組み込んでいます。
この拡張されたレパトアは、発見成功率を最大化し、構造的エピトープのカバレッジを広げるように設計されています。
FR2エンジニアリング：スクリーニング成功率と開発可能性の向上
ヒト重鎖では、37、44、45、47位（Martinナンバリングスキーム）のFR2残基がVH-VL界面の一部を形成します。これらの残基は通常疎水性で、VGLW（Val-Gly-Leu-Trp）モチーフで表され、通常は従来のヘテロ四量体抗体内に埋もれています。（Sangら、2022年、Structure）
しかし、重鎖のみまたはVHH形式では、これらの位置はより溶媒に露出します。天然のラクダ科重鎖のみの抗体は、これらの位置により親水性の残基を有し、最も顕著なのは特徴的なFERF
（Phe-Glu-Arg-Phe）モチーフです。（Sangら、2022年、Structure）
露出した疎水性残基をより親水性の残基に置き換えることで、FR2ラクダ化は不要な疎水性相互作用を低減し、凝集を軽減して、候補分子の全体的な開発可能性を向上させます。
比較研究により、FERFモチーフを組み込んだヒト化ライブラリーは、ヒトVGLWモチーフに基づくライブラリーよりも、有効なリード候補を単離するスクリーニング成功率が高いことが示されています。（Arrasら、2023年、mAbs）
当社の社内データはさらに、ラクダFR2シグネチャーを保持する臨床段階のVHHが、ヒトVGLWモチーフを持つVHHよりも高い発現収量と優れた熱安定性を示すことを示しています。
次世代RenNano®の戦略的優位性
- 凝集リスクの低減と開発可能性の向上：
より親水性の高いFERFフレームワークは、不要な疎水性相互作用と凝集リスクの低減に役立ち、溶解度の向上、非特異的結合の低減、全体的な開発可能性の改善、リード同定成功率の向上をサポートします。
- デュアルエンジン配列多様性：
完全なヒトV遺伝子（VGLW）と設計されたFR2ラクダ化ヒトV遺伝子（FERF）を組み合わせ、標的化が困難なエピトープにわたる候補の多様性を拡大します。
- 完全ヒト由来の可能性の保持：
元のヒトV遺伝子レパトアを保持し、未修飾のヒト配列が好まれる場合に、発見キャンペーンが完全ヒトVHHを引き続き生成できるようにします。
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生体内
親和性成熟：
天然の生体内
親和性成熟を可能にし、高親和性VHHリードの創出と下流の最適化の合理化を実現します。
FR2ラクダ化は大腸菌
での可溶性VHH発現を向上させる
FR2ラクダ化は大腸菌
での可溶性VHH発現を大幅に向上させ、100%の発現成功率と著しく高い発現収量を達成します。
RenNano®マウス由来のVHHは大腸菌で発現させ、社内で精製しました。データは中央値と四分位範囲で示されています。
FR2ラクダ化ヒトVHH-Fcは有意に向上した親水性を示す
疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）分析により、FR2ラクダ化VHH-Fcが有意に短い保持時間を示し、表面親水性の顕著な向上とより良好な溶解度プロファイルを示すことが実証されました。RenNano®由来のVHH-FcはCHO細胞で発現させ、社内で精製しました。データは中央値と四分位範囲で示されています。
FR2ラクダ化VHHは著しく改善されたモノマー純度を示す
FR2ラクダ化VHHは改善されたモノマー純度を示し、厳格な純度閾値（>80%、>90%、>95%）を満たすクローンの割合が有意に高くなっています。RenNano®由来のVHHはCHO細胞または酵母で発現させ、社内で精製しました。11個の完全ヒトVHHはすべて酵母で発現し、60個のFR2ラクダ化VHHのうち、10個は酵母で、50個はCHO細胞で発現しました。
